Screening for Carriers of Tay-Sachs Disease wśród Żydów aszkenazyjskich – Porównanie testów opartych na DNA i enzymach czesc 4

Próbki w ścieżkach 7 i 9 nie były trawione; te w ścieżkach 8 i 10 były trawione Ddel. Fragment 35 pz w ścieżce 10 jest często blady, ale konieczne jest jedynie wykrycie fragmentu o długości 85 pz, aby sklasyfikować próbkę jako próbkę z nośnika. Ścieżki 11 do 14 analizowano za pomocą strategii dla egzonu 7: ścieżki 11 i 12 reprezentują próbkę od zdrowego osobnika, a ścieżki 13 i 14 próbkę od nośnika heterozygotycznego pod względem mutacji egzonu 7 u osób z chorobą o początku dorosłości. Próbki w ścieżkach 11 i 13 nie zostały strawione; te w ścieżkach 12 i 14 trawiono EcoRII. Gwiazdka oznacza dwa heterodupleksowe prążki charakterystyczne dla stanu heterozygotycznego dla mutacji insercji o 4 bp. Próbki (5 .l niestrawionego DNA i 10 .l strawionego DNA) do analizy pobrano ze wzmacnianego produktu probówki reakcyjnej i 2 U odpowiedniego enzymu restrykcyjnego – HaeIII, DdeI (oba enzymy z New England Biolabs, Beverly, Mass .), lub EcoRII (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) – dodano. Po inkubacji próbek przez dwie godziny w temperaturze 37 ° C, analizowano je za pomocą elektroforezy na 8% żelu poliakryloamidowym, a następnie barwieniu bromkiem etydyny i wizualizacji za pomocą fluorescencji w ultrafiolecie. Strategie amplifikacji i analizy pokazano na rysunku 1.
Wyniki
Strategie analizy DNA
Próbki analizowano pod kątem trzech znanych mutacji HEXA u Żydów aszkenazyjskich za pomocą amplifikacji DNA z reakcją łańcuchową polimerazy i trawieniem enzymem restrykcyjnym, a następnie elektroforezą w żelu poliakryloamidowym (Fig. 1). Mutacje można wykryć, ponieważ każde z nich tworzy charakterystyczny nowy prążek we wzorze z fragmentem restrykcyjnym amplifikowanego produktu (Fig. 1D).
Najbardziej powszechną z mutacji, wstawkę o długości 4 pz w eksonie 11 (ryc. 1A), zidentyfikowano zarówno w stanach heterozygotycznych (ryc. 1D, ścieżki 3 i 4), jak i w stanach homozygotycznych (ścieżki 5 i 6) przez trawienie amplifikowany produkt z enzymem restrykcyjnym HaeIII. W obecności insertu o 4 bp widziano raczej pasmo 47 bp niż pasmo 43 bp. Gdy produkt został rozdzielony przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym, ale nie agarozowym, niestrawiony zamplifikowany produkt heterozygot zawsze zawierał dwa dodatkowe prążki, które migrowały wolniej (ryc. 1D). Te prążki to heterodupleksy powstałe w wyniku hybrydyzacji nici DNA ze zamplifikowanych normalnych i zmutowanych alleli33. Gdy heterologiczne produkty ulegają hybrydyzacji, wstawka o 4 bp tworzy pęcherzyk, który spowalnia migrację dupleksu w żelu poliakrylamidowym. Ponieważ dowolna nić zamplifikowanego zmutowanego produktu może łączyć się ze swoim odpowiednikiem w normalnym zamplifikowanym produkcie, powstają dwa typy heterodupleksów, które migrują z różną szybkością.34 Heterodupleksy zapewniają prosty test diagnostyczny dla nosicieli mutacji insercji o 4 bp.
Strategia wykrywania intronowej mutacji 12 połączeń splotowych (ryc. 1B) została opisana poprzednio.23 Podstawienie zasadą G-to-C na końcu 5 intronu 12 stworzyło nowe miejsce DdeI, produkując dwa fragmenty (85 i 35 bp) z fragmentu DdeI o wielkości 120 pz (ryc. 1D, ścieżki 7 do 10).
Detekcja mutacji eksonu 7 powiązana z chorobą o początku dorosłości była oparta na utracie miejsca EcoRII z powodu substytucji nukleotydowej G-to-A na końcu 3 eksonu 7 (strategia przedstawiona na Fig. 1).
[podobne: ebola kraków, morfologia krwi wbc, olx raciąż ]