Screening for Carriers of Tay-Sachs Disease wśród Żydów aszkenazyjskich – Porównanie testów opartych na DNA i enzymach cd

Wyekstrahowany DNA ponownie zawieszono w 50 .l wody i do każdej reakcji amplifikacji użyto od 2 do 3 .l (co odpowiada 100 do 200 .l pełnej krwi). Ogólnie, ekstrakcja DNA dała bardziej spójne amplifikacje. Amplifikacja genomowego DNA przez reakcję łańcuchową polimerazy
Docelowe sekwencje amplifikowano od 0,5 do 1,0 .g genomowego DNA lub bezpośrednio z peletek lub lizatów leukocytów wytworzonych zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą dekstranu. 32 Reakcje amplifikacji przeprowadzono w 50 .l objętości zawierającej 100 pmoli każdego startera oligonukleotydowego; 1,5 mmola trifosforanu deoksyadenozyny, trifosforanu deoksycytydyny, trifosforanu deoksyguanozyny i trifosforanu deoksytymidyny na litr; i 1,25 do 2,5 jednostek rekombinowanej polimerazy Taq (Amplitaq, Cetus, Emeryville, CA) w 10 mM chlorowodorku TRIS (pH 8,3), 50 mM chlorku potasu, 1,5 mM chlorku magnezu i 0,01 procent żelatyny, zgodnie z zaleceniami producenta. Amplifikację przeprowadzono przez 30 cykli w termocyklerze DNA Perkin-Elmer-Cetus; każdy cykl składał się z 30 sekund denaturacji w 94 ° C, 30 sekund hybrydyzacji w 55 ° C (lub w 60 ° C dla pary oligonukleotyd-primer zastosowanej do amplifikacji eksonu 7) i 90 sekund wydłużenia w 72 ° C. Podjęto środki ostrożności w celu uniknięcia kontaminacji łańcuchowych reakcji polimerazy przez DNA i objęto kontrolą negatywną. Do analizy wybrano elektroforezę żelową próbek użytych w reakcjach, ponieważ bezpośrednia wizualizacja pozwoliłaby na bardziej szczegółową ocenę kontroli jakości. Mutacje, które badaliśmy, zostały również przeanalizowane za pomocą testu dot-blot.24, 27
Rysunek 1. Rysunek 1. Strategie używane do wykrywania trzech mutacji HEXA i odpowiadających im fotografii DNA. Linia centralna każdej strategii reprezentuje segment DNA amplifikowany przez startery oligonukleotydowe, które są reprezentowane przez poziome strzałki. Grubszy segment linii reprezentuje egzoniczną część segmentu DNA, który ma zostać wzmocniony, a cieńszy segment stanowi część intronową. Sekwencja starterów oligonukleotydowych jest pokazana poniżej każdej strategii. Groty wskazują położenie miejsc restrykcyjnych enzymów używanych do analizy amplifikowanych produktów; groty w nawiasach są obecne (jak w strategii dla intronu 12) lub nieobecne (jak w strategii dla eksonu 7) w zmutowanym allelu. Otrzymane wielkości fragmentów restrykcyjnych wyrażono w parach zasad powyżej każdej linii. Gwiazdka w strategii dotyczącej eksonu 11 oznacza lokalizację mutacji insercji o 4 bp.
Na fotografiach rozmiary fragmentów restrykcyjnych wyrażono w parach zasad. Strzałki oznaczają nowe pasma utworzone w obecności mutacji. Ścieżki do 6 zawierają próbki analizowane ze strategią dla egzonu 11: ścieżki i 2 przedstawiają próbkę od zdrowego osobnika, ścieżki 3 i 4 próbkę od nośnika heterozygotycznego pod względem mutacji insercji 4-bp i ścieżki 5 i 6 próbka od pacjenta z dwoma allelami insercji 4-bp. Próbki w ścieżkach 1, 3 i 5 nie zostały strawione; te w ścieżkach 2, 4 i 6 strawiono Haillll. Ścieżki 7 do 10 pokazują próbki analizowane ze strategią dla intronu 12: ścieżki 7 i 8 reprezentują próbkę od zdrowego osobnika, a ścieżki 9 i 10 próbkę od heterozygotycznego nośnika intronu 12 mutacji splotu złącza
[więcej w: ropne zapalenie migdałków, flixonase nasule, gruźlica prosówkowa ]