Analiza genotypów HLA-DQ i wrażliwości na cukrzycę zależną od insuliny cd

Większość tych sekwencji pochodzi z Todd i in. 12, 13 A kontrolny oligonukleotyd (5 -3 CGCTTCGACAGCGACGT) zaprojektowany z konserwatywnego regionu spośród alleli DQ (aminokwasy 39 do 44 w domenie DQ.1) zastosowano jako kontrolę amplifikacji. w celu zademonstrowania obecności produktu z łańcuchem beta DQ, nawet gdy allel nie był wykrywalny z użyciem którejkolwiek z użytych sond (tj. pustej próby DQ). Wszystkie filtry, z wyjątkiem sondowanych oligonukleotydem DQw4, przemyto następnie roztworem chlorku tetrametyloamoniowego (500 g chlorku tetrametyloamoniowego [pH 8,0], 5,6 ml 0,5 M EDTA [pH 8,0] i 7 ml 20 procent dodecylosiarczanu sodu, z dodaną wodą destylowaną do 1400 ml) przez 25 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w różnych temperaturach (zależnie od oligonukleotydu) przez dodatkowe 25 minut. Filtry sondowane oligonukleotydem DQw4 przemywano w 1x SSC przez 25 minut w 42 ° C. Procedury te usunęły każdą sondę, która miała jedną lub więcej niezgodności z sekwencją docelową. Osoby z haplotypem HLA-DR7DQw2 odróżniano od haplotypu z haplotypem HLA-DR3DQw2 w analizie genu łańcucha alfa DQ przy użyciu sondy oligonukleotydowej, DQ alfa-7 (5 -CTGTTCCACAGACTTAG-3 ), która rozpoznaje różnica między łańcuchami DQ alfa, ale nie łańcuchami beta DQ tych dwóch alleli. To ostatnie rozróżnienie ma kluczowe znaczenie, ponieważ HLA-DR3DQw2 jest dobrze znanym markerem wrażliwości w IDDM, podczas gdy HLA-DR7DQw2 nie jest, mimo że oba haplotypy mają alaninę w pozycji 57 swojego łańcucha beta DQ.
W niektórych przypadkach niezbędne było poznanie przypisania DR przez typowanie serologiczne w celu przypisania haplotypu (tj. HLA-DR4DQw7 vs. HLA-DR5DQw7). W innych okolicznościach przeprowadzono dodatkowe reakcje łańcuchowe polimerazy w celu jednoznacznego przypisania haplotypów (tj. HLA-DR3DQw2 vs. HLA-DR7DQw2). Zasadniczo wyniki te pokazały, że dokładne typowanie HLA-DR / DQ można osiągnąć poprzez powszechne badanie przesiewowe oligonukleotydów swoistych dla alleli.
Ze względów technicznych albo słabe wzmocnienie sekwencji, albo pozorne wykrycie trzech alleli wykluczono 15 pacjentów. Trzech innych pacjentów zostało wykluczonych, ponieważ nie było możliwe ustalenie, czy mają one haplotyp HLA-DR7 / DR7 lub HLA-DR3 / DR7 na podstawie dostępnych danych dotyczących typowania serologicznego i DNA. To rozróżnienie było ważne w dalszej analizie tych danych.
Analiza statystyczna
Tabela 1. Tabela 1. Częstotliwości genów HLA-DQ u osób zdrowych i pacjentów z IDDM. Częstotliwości genów (Tabela 1) obliczono na podstawie częstotliwości, z którymi zaobserwowano allele przy użyciu wzoru g = – pierwiastka kwadratowego z (1-f), w którym g jest częstotliwością genu i f obserwowaną częstotliwością allelu. Ponieważ badano tylko osoby niezwiązane, nie dokonano rozróżnienia pomiędzy homozygotycznością dla danego allelu a obecnością allelu łańcucha DQ, którego nie można zidentyfikować ( puste ). Istotność różnic w częstości alleli określano za pomocą analizy chi-kwadrat z poprawką Yatesa. Ilości szans obliczono metodą Woolfa przy użyciu wzoru (a × d) / (b × c) i zgodnie z konwencją wyrażono jako względne ryzyko
[przypisy: jakie badanie na tarczyce, stulejka kraków, gruźlica prosówkowa ]