Analiza genotypów HLA-DQ i wrażliwości na cukrzycę zależną od insuliny ad

Jednakże, w przeciwieństwie do innych raportów, stwierdziliśmy, że pojedynczy allel łańcucha DQ zawierający kwas asparaginowy nie był ochronny dla IDDM. Wnioskujemy, że dokładna ocena podatności na IDDM wymaga kompletnego typowania HLA-DQ, a nie tylko analizy łańcucha beta HLA-DQ dla kwasu asparaginowego w pozycji 57. Metody
Populacja pacjentów
Zbadano dwustu osiemdziesięciu czterech niespokrewnionych białych pacjentów z IDDM zgodnie z kryteriami National Diabetes Data Group. Pacjenci byli rekrutowani przez ogłoszenia radiowe; do włączenia do badania, musieli mieć nienaruszonego rodzeństwa poniżej 18 roku życia. Rozpoznanie IDDM u każdego pacjenta zostało potwierdzone przez jednego praktyka pielęgniarskiego i uzyskano próbkę krwi. Średni wiek 284 pacjentów w chwili wystąpienia cukrzycy wynosił 9,3 lat (zakres od 6 do 34), a średni czas trwania cukrzycy wynosił 7,2 roku (zakres od 4 do 14). Było 144 pacjentek i 140 mężczyzn. Trzynastu z nich miało krewnych pierwszego stopnia z IDDM iw tych przypadkach badano tylko najstarsze rodzeństwo.
Populacja kontrolna składała się z 203 losowo wybranych normalnych białych (101 kobiet i 102 mężczyzn, średni wiek, 22 lata, zakres od 19 do 35). Żadne z nich nie miało rodzinnej historii IDDM i każdy opisywał siebie jako bez cukrzycy, ale glukozy we krwi nie mierzono u tych osób. Z nielicznymi wyjątkami wszyscy pacjenci byli typowani do HLA-A, B i C metodą mikrocytotoksyczności w National Institutes of Health. Próbki surowicy do pisania zostały przygotowane lokalnie lub uzyskane w zamian od innych badaczy. Typowanie HLA-DR przeprowadzono na limfocytach B uzyskanych z krwi obwodowej przy użyciu podobnych metod cytotoksyczności z przedłużoną inkubacją.
Ekstrakcja DNA i reakcja łańcuchowa polimerazy
DNA ekstrahowano ze świeżych lub zamrożonych limfocytów krwi obwodowej standardowymi technikami. 12 14 14 15 Pierwsza domena genu łańcucha beta DQ została zamplifikowana z genomowego DNA przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy. 16, 17 Użyte startery były DQL (5 -GATTTCGTGTACCAGTTTAAGGGC-3 ) i DQR (5 -CTGGTAGTTGTGTCTGCACAC-3 ), które mają produkt około 270 par zasad. Amplifikację prowadzono przez 40 cykli z .g genomowego DNA i 0,5 . termostabilnej polimerazy Taq (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, Conn.). Ponadto do amplifikacji DNA pacjentów typowanych jako HLA-DQw2 zastosowano dwa startery łańcuchowe DQ alfa, DQAL (5 -GGTGTAAACTTGTACCAGTCTTAC-3 ) i DQAR (5 -AGCAGCGGTAGAGTTGGAGCGTT-3 ), w celu rozróżnienia pomiędzy osobami z HLA-DR3DQw2 i tymi z haplotypem HLA-DR7DQw2.
Analiza dot-blot przy użyciu oligonukleotydów specyficznych dla allelu
DNA naniesiono na membranę nylonową MSI Magnagraph (MSI, Westboro, MA), wypiekano przez jedną godzinę w 80 ° C i prehybrydyzowano przez 30 minut w 42 ° C (6 x SSC [1 x SSC to 0,15 M chlorek sodu i 0,015 M cytrynian sodu], 0,5 procentowy dodecylosiarczan sodu, 5 x roztwór Denhardta i 100 .g denaturowanego DNA plemników łososia na mililitr). Filtry inkubowano w tym samym roztworze przez noc w 42 ° C z sondami oligonukleotydowymi zaprojektowanymi do rozróżniania między specyficznymi allelami w locus łańcucha DQ beta (specyficzne dla allelu sondy oligonukleotydowe 5 -3 : DQw1.1, GGCGGCCTGTTGCCGAG; DQw1.2 , GGCGGCCTGATGCCGAG; DQw1.AZH, GGCGGCCTAGCGCCGAG; DQw2, GCTGGGGCTGCCTGCCG; DQw7 (dawniej DQw3.1) GGCCGCCTGACGCCGAG; DQw8 (dawniej DQw3.2) GGCCGCCTGCCGCCGAG; DQw4, GGCGGCTCGACGCCGAG oraz DQw1.12, GGCGGCCTGACGCCGAG)
[podobne: ropne zapalenie migdałków, staloral 300, jakie badanie na tarczyce ]